质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。在基因工程中，质粒制备可将质粒作为目的基因的载体，在新的宿主生物体中正常表达。质粒DNA可以作为疫苗或治疗性药物单独使用，或在病毒载体生产中作为病毒包装的原料。

质粒制备的步骤

质粒制备流程图

质粒制备常见问题

Q：转化后克隆数量少

A：可以设置阴性和阳性对照。克隆过程中，阴性对照-空载长出菌落，判定可能是酶切不完全导致，阳性对照不出斑，可能是转化实验的操作出现问题。感受态细胞切勿反复冻融，且热激时间一定要精准到秒，同时正确使用抗生素或其他筛选标记。

Q：菌落太多但假阳性率高，挑不到正确克隆

A：菌落PCR鉴定引物需跨区域设计，一条引物设计在载体上，另外一条在目标片段上。如此可避免假阳性克隆又筛除反向插入片段，还可以通过提取质粒酶切跑胶进一步排除错误克隆。

Q：大肠杆菌老化

A：建议涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

Q：质粒未全部溶解

A：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

Q：质粒提取不成功

A：裂解时间过长，一般不应超过5分钟。吸附时间，溶解时间不够都会导致质粒DNA提取实验失败。

质粒制备|必威生物

必威生物拥有完善的质粒制备生产线，确保提供无RNA污染、无基因组污染的高质量无菌质粒，可将内毒素含量控制在较低水平（< 100EU/mg、<30EU/mg、<5EU/mg，供选择）。另外我们还提供序列验证、限制酶酶切和内毒素分析等服务，满足各领域客户多样化的下游应用，如转染、抗体制备，疫苗和基因治疗研究等。

案例分享——转染级质粒制备

将质粒转化后挑取单克隆菌落进行培养，抽提菌液进行酶切及测序验证，对符合要求的质粒进行大批量接菌抽提，之后对各批次抽提质粒进行酶切验证，无误后混合所有抽提质粒，最后对大抽质粒进行去内毒素处理，48h细菌检测如图1所示。

图1 内毒素检测

内毒素检测结果为阴性对照不凝固，阳性对照凝固，测试稀释样品不凝固，标准品不凝固，证明去内毒素处理成功。

经过细菌检测结果比对，48h无抗培养基均不长斑，通过无菌检测。